L-苯丙氨酸生产及应用研究进展.

('L-苯丙氨酸生产及应用研究进展L-苯丙氨酸的研究背景国内外L-苯丙氨酸的供需现状L-苯丙氨酸的理化性质L-苯丙氨酸的主要应用L-苯丙氨酸的生产工艺提高L-苯丙氨酸产量的策略展望主要内容二、四、五、六、七、一、L-苯丙氨酸的研究背景：・・L・苯丙氨酸是具有旋光性的芳香族氨基酸，是人体所需八种必需的氨基酸之一，人和动物不能在体内自行合成，必须从外界摄取，在人体代谢过程中具有重要作用。•:・最早由schulze于1879年从羽扇豆幼苗中发现与分离得到,后来Fischer于20世纪初从动物性蛋白质中成功分离得到。苯丙氨酸的主要光学异构体有L-苯丙氨酸、D•苯丙氨酸、DL•苯丙氨酸，其中L•苯丙氨酸最为重要。•:•自然界广泛存在于卵乳和动物蛋白中，含量5%-6%,植物性蛋白质中约含1%。L・苯丙氨酸还主要存在于纤维蛋白及血红蛋白中，影响甲状腺激素和毛发、皮肤的黑色素，还参与消除一些内脏的功能的损耗。它广泛应用于医药、食品和化工等行业。、L-苯丙氨酸国内外的供需情况量超过2万吨，约占世界需求量的一半。西欧和日本也是主要的消费市场。・:•现在全球L-苯丙氨酸的主要生产国有：美国（以纽特公司为主）年产8000吨左右，H本（以味之素公司为主）年产5000吨左右，韩国（以大象公司为主）年产3000吨左右，荷兰（以DSM公司为主）年产3000吨，法国年产3000吨，德国有少量生产，年产量约为800吨。长期以来，美国纽特、日本味之素、韩国大象公司、荷兰DSM这几家公司基本上垄断和控制了全球L-苯丙氨酸的产量和价格。际市场供需现状I三.在1998年以前主要受缚于技术水平、菌种等因素，我国L•苯丙氨酸基本依赖进口。中国科学院成都生物研究所于1991年成功开发了红酵母苯丙氨酸解氨酶（PAL）/肉桂酸技术途径，并于1998年与企业合作建成）了一套年产100t的生产设备生产L•苯丙氨酸，使我国成为继美、日、（德、韩之后又一个能够工业化生产L•苯丙氨酸，并自主开发这一高新技术的国家。I20世纪80年代中期，国外逐步淘汰酶法生产，而改用直接发酵法，成本大大降低，促使国内许多苯丙氨酸生产企业被迫停产。2009年，我国L•苯丙氨酸产业的被动局面终于被打破，L•苯丙氨酸生产技术取得了突破性进展。由于拥有了自主知识产权的高产酸L•苯丙氨酸基因工程菌及工业化生产技术，突破了技术和菌种的约束，使我国L•苯丙氨酸生产进入了国际先进行列•:-2010年我国市场上L■苯丙氨酸的需求量达到1万吨，其中用于合成阿斯巴甜的用量约为8000吨，医药用多种氨基酸大输液用量和医药中间体制造用量为1500吨左右，饲料添加剂、食品添加剂、营养添加剂、合成维生素等用量为300吨左右O：・・目前国内仅有5家企业生产L-苯丙氨酸，即福建省麦丹生物集团有限公司、丽珠集团福州福兴医药有限公司、江苏汉光甜味剂有限公司（江苏汉光生物工程有限公司）、潔阳维国内L-Phe的研究发展及供需情况L-苯丙氨酸的理化性质•L■苯丙氨酸即为L・a■氨基叩■苯丙酸简称为L-pheo•:•苯丙氨酸的分子式：分子量为165.19•:•化学结构式为：NH2CgH^NO^>L-Phe为白色片状晶体或白色结晶性粉末。»略有特殊气味和苦味。A在受热、光照、空气中稳定>L-Phe熔点为270-275C,沸点为329.5°C(at760mmHg),闪点为153.1°C。》易溶于甲酸，溶于水，微溶于醇，不溶于乙醛。pnyialanln苯丙氨酸作为食品添加剂。主要用来作为合成阿斯巴甜，阿斯巴甜是一种优良的低热量甜味剂，具备了安全、美味、高甜度三大优点，而成为当今风靡世界的最优秀的甜味剂。另外L•苯丙氨酸还广泛应用于功能性食品的氨基酸方面，补充了人体所需，同时可改善烘烤食品香味近.②苯丙氨酸在医药领域的应用苯丙氨酸是人体自身所不能合成的且必需的八种氨基酸之一，一直是临床医药氨基酸输液的重要成分。L-苯丙氨酸除了直接用于医用复合氨基酸输液和合成医药外，还可用来配制医药的培养介质。用L•苯丙氨酸合成的医药有HIV蛋白酶抑制剂、凝乳酶、抗肿瘤药物对氟苯丙氨酸、脑神经传递素等。③其他领域近年来，L•苯丙氨酸的应用领域还在不断拓展，如以L•苯丙氨酸及其衍生物为原料合成手性中间体技术；•:・L-苯丙氨酸的制备方法主要有天然蛋白质水解法、化学合成法、酶法、微生物发酵法。前三种方法主要存在着收率低、成本高、对环境污染严重等缺点，未能得到进一步的工业化应用，现在基本被淘汰。目前国内外主要采用发酵法。-—和、L-苯丙氨酸的生产工艺L-苯丙氨酸的应用①苯丙氨酸在食品行业中的应用1、提取法・:•提取法即天然蛋白质水解法，是指以天然产物（如）脱脂大豆）为原料，通过分离纯化等方法生产L•苯丙氨酸的方法。j<•缺点：由于天然蛋白质中L-苯丙氨酸含量较低，该j工艺较复杂，分离提纯较困难，产品质量不稳定，生产成本高，所以此法较少在国内外采用。张以苯乙醛为原料，经鼠醇.氨基睛等合成苯丙氨酸。•该法加入了剧毒的氟化物，三废处理困难，有的副反应较多，对设备和操作的要求较高，同时有害于操作人员的身体健康。）②缩合法•一般先将甘氨酸乙酰化，获得乙酰甘氨酸，再与苯甲醛缩合成乙酰氨基肉桂酸I内酯,后者经水解、电解、还原、酶水解，即得到L-Phe»j•:・该路线合成苯丙氨酸工艺路线长、步骤多，收率较低。③不对称合成法•乙酰氨基肉桂酸在铐与双・（N・3,4二氯苯甲酰・2,4二苯基磷亚甲基）•毗咯络合物催化下，加氢生成L・N・乙酰苯丙氮酸，在经水解即得到L-Pheo•催化剂价格昂贵，需要解决反应后催化剂的分离回收和再生问题。④其他方法•>日本的尾岛岩提出用苯基环氧乙烷和乙酰胺、CO、H2为原料，在钻催化下，氨化竣化制得L•苯丙氨酸。此外还有人提出节基乙内酰腺法等。〈2、化学合成法•:-酶法主要是化学合成的类氨基酸前体经过微生物细胞内酶系高效地催化合成L-Phe»•普遍认为苯甲醛一＞海因苯丙酮酸-苯丙氨酸或苯甲醛-肉桂酸-苯丙氨酸的路线是最佳方案。(1)通过转氨酶反应合成L•苯丙氨酸•:-这种方法主要是以苯丙酮酸(PPA)为前体，L•天冬氨酸(L-Asp)为氨基供体,通过转氨酶酶法合成L•苯丙氨酸。(2)通过苯丙酮酸脱氢酶反应合成L-苯丙氨酸1984年首次报道，具有苯丙氨酸脱氢酶的短杆菌，通过与甲酸脱氢酶反应体系相偶联，使辅酶NADH得以再生，使得在同一个生物反应器中连续转化苯丙酮酸生成L•苯丙氨酸。1999年，徐虹等通过利用大肠杆菌EP8-10经培养后产生高活力转氨酶和低活力的天冬氨酸酶，而E.coliEA・1则产生高活力天冬氨酸酶和很低的转氨酶，耦合EP8-10中转氨酶和EA・1中Asp酶作用，由苯丙酮酸和富马酸生成L-Pheo(4)用苯丙氨酸氨解酶由肉桂酸生产L-苯丙氨酸•苯丙氨酸解氨酶(PAL)可以催化生产肉桂酸与氨，此为可逆反应。用黏红酵母在含L・Phe的培养基内所生长的该菌体中诱导，可产生苯丙氨酸解氨酶。在培养基中加入异亮氨酸后，在使酶稳定及在最佳条件时，向反应液中加入反式肉桂酸时生产L•苯丙氨酸。•:-酶法生产具有产物浓度高，产物组分相对单一易于后加工处理，生产能力强等优点。缺点是底物和酶等主要原料成本高、来源有限，反应过程中酶稳定性差等，酶法生产L-Phe受到了制约。3、(3)用酰基转移酶由乙酰胺肉桂酸制备L-苯丙氨酸•原料先在酰基转移酶的作用下生成"氨基肉桂酸，再自发转化为苯丙酮酸，最后由苯丙酮酸的转氨反应生成L•苯丙氨酸。•发酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生产L-Phe的一种方法•发酵法培养基有糖质的和非糖质的两种(一般采用苯丙酮酸、甲醇乙醇与乙酸为原料)，由于所使用的原料及菌种不同，致使发酵液中产物的含量相)差很大，要想获得苯丙氨酸的高效率，主要需要选择高产菌株及合理调节代谢过程。冬•微生物发酵法具有原料廉价易得、环境污染较小、产物纯度高、可大规模生产等优点。(①使用酵母菌生产L•苯丙氨酸使用酵母菌生产L•苯丙氨酸从天然环境中分离到一株具有较高苯丙氨酸氨解酶(PAL)活性的菌株，以此为出发菌株进行UV和EMS诱变处理，所得菌株较原菌株酶活力有较大提高。大庆高新技术产业开发区邢军筛选得到一种黏红酵母，该黏红酵母生产苯丙氨酸解氨酶最佳发酵条件为：起始PH=5.5,接种量10%(体积分数)，温度28°C,发酵周期20h,终点PH=8.0oI苯丙氨酸条件进行了优化。通过人工诱变选育所获得的乳糖发酵短杆菌FMP92814可利用较粗放的农副产品(淀粉水解糖、玉米糖浆、豆饼粉水解液、糖蜜)作原料发酵生产苯丙氨酸，可以降低生产成本，适合目前各氨基酸工业推广。③使用假单胞菌生产L•苯丙氨中国科学院成都生物研究所陈斌将从土壤中筛选假单胞菌/(Pseudomonassp.)E4-106株细胞进行了L・Phe生产实验。实验显)示转氨反应最适温度35・40-C；在pH值为7・10内催化反应而活力变化不大;表面活性剂处理细胞或在反应液中加入Mg2•能显著提高转氨反应速度。在此反应体系中，E4-106菌株单位湿重细胞的转氨酶活力为1039U/g;当产物L•苯丙氨酸质量浓度为32.2gL"和50.4gL，时,苯(丙酮酸摩尔转化率分别为97.5%和87.2%,产物回收率为81.8%。4、微生物发酵法•;・复旦大学微生物学系范氏胜由短杆菌变异株FMP92814山发对其产五、提高L-苯丙氨酸产量的策略•1、利用基因工程技术构建L■高产菌株•2、利用发酵工程技术促进L■苯丙氨酸的生产•3、改进分离纯化技术•:•基因工程法生产苯丙氨酸是一种新的合成方法，传统育种提高苯丙氨酸的产量有限•随着基因工程和分子生物学的发展，以及对大肠杆菌芳香族代谢机制的了解L•苯丙氨酸的基因工程菌分子育种孕育而生。（一）L-Phe的生物代谢途径及其调控■L■苯丙奴酸合成的起始物为五碳糖磷酸途径的中间产物赤參糖・4.磷酸（E4P）和糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）二者缩合形成一个七碳醐糖开链磷酸化合物称为3■脱氧-阿拉伯庚酮糖酸・7•磷酸（DAHP）,然后DAHP转化为莽草酸（SHIK）,然后再1、利用基因工程技术构建L-高产菌株r\\灘鶴肠巔（PER赤师4強（E.4.R［（EMPDS转化为分支酸（CHA）,由分支酸合成苯丙酮酸（PPY）,最后苯丙酮酸经转氨作用生成L•苯丙氨酸。■苯丙氨酸合成途径有多调控位点.如图所示。其中DAHP合成酶（DS）,分枝酸变位酶（CM），和预苯酸脱水酶（PD）是受控的关键酶。转氨酶（AT）则是合成途径中最后步催化苯丙酮。（二）基因工程分子育种可从以下几个方面入手（1）宿主的选择在选择宿主微生物时，需要考虑以下因素：克隆的可能性、质粒转移及重组的可能性、环境污染、中间产物的获得、应用原料的范围，宿主生理学和遗传背景等。综合考虑以上因素，大肠杆菌为首选，它是能利用简单培养基快速牛长的菌株。（2）加速限速反应，扩增表达L-苯丙氨酸合成代谢过程限速酶的基因。苯丙氨酸的合成在许多关键点上受到调控，调控的途径多种多样，通过关键酶基（3）改变代谢流，调整L-苯丙氨酸代谢流敲除负调控基因o①共同途径上代谢前体物的积累的研究代谢途径分为共同途径和分支途径，共同途径为分支途径提供前体物质；对共同途径的研究在于代谢过程的关键分支点。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是各个酶系竞争的对象：丙酮酸激酶（PYK）将PEP转化为丙酮酸，PEP竣化酶、PEP竣激酶将PEP和CO?转化为草酰乙酸。Gulber等在研究PYK的功能时，根据蛋白N端序列合成引物，得到126bp的片段，用同源重组的方法使PYK基因失活，尽量减少PEP流向丙酮酸生成的方向，为DAHP的合成提供更多的原料。②打断竞争的代谢支路芳香族氨基酸合成途径中分支酸之后碳源分别流向L-Tyr.L・Trp和L-Phe的合成，显然必须减少碳源在L・Tyr和L・Trp合成途径中的流量，从而使碳源能够更多的用于L-Phe的合成。③构建代谢旁路。用代谢工程的方法可阻断或降低副产物的合成。乙酸是大肠杆菌糖代谢的一个终末产物，对大肠杆菌有毒。近年，有人将枯草杆菌乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中，明显改变糖代谢流，使乙酸浓度保持在低于对细胞有毒害水平。因的克隆表达和去除产物苯丙氨酸的反馈抑制双重手段加速限速反应。如从苯丙氨酸生产菌株中克隆了脱酶的DS、CM及PD酶基因，并将它们串联起来，克隆到1)发酵培养基的优化•碳源是微生物发酵工程中最为重要的影响因素之一。葡萄糖是PTS系统(磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统)碳源，会产生葡萄糖效应，对参加代谢过程的一些酶产生阻遏作用;发酵会持续产生对菌体生长和产物生成有抑制作用的乙酸。因此需要寻找性能优良的新型碳源用于微生物发酵。E.col除可以利用葡萄糖外，还可以以甘油.阿拉伯糖、醋酸酯、葡糖酸盐为碳源合成L-Phe<>这些非PTS系统碳源的利用不仅可以降低副产物乙酸的合成，还可降低PTS对于PEP的竞争分流，使PEP更多地用于合成L-Phe,从而提高L-Phe的理论产量。大肠杆菌用甘油的研究已经进行的比较充分。一些研究结果也表明以甘油为碳源合成苯丙氨酸的效率明显高于以葡萄糖为碳源时的效率.•:・(2)发酵温度的控制<•对于重组菌株而盲•，温度是关键酶的表达和质粒稳定性的一个重要影响因素。合理的温度控制方法或策略对于L-Phe的发酵十分重耍。对于E.col,其最适生长温度一般为379,温度过低会抑制其体内酶的活性，温度过髙又会使菌株体内的代谢失活，这都不利于产物的合成而对于关键酶基因的表达载体为温度诱导型质粒，温度是发酵条件之一.并且还有诱导剂的作用。•溶氧是影响发酵的关键因素之一，合理的溶氧对于L-Phe的发酵十分重要。(4)底物流加策略。•:・Gerigk.M等对L-Phe发酵生产过程中的葡萄糖的浓度和流加方式，研究表明在发酵过程中持续维持葡萄糖浓度在5g/L左右就可显著促进L-苯丙氨酸的生产。(5)噬菌体污染的防治噬菌体污染在氨基酸工业发酵中造成了很大的经济损失。要解决该问题，应采取综合治理措施，一方面杜绝活菌在环境中的扩散或排放，另一方面采取不同菌种更替使用或筛选抗噬菌体菌株的方法来保证生产长期稳定的进行。利用发酵工程技术促进L-苯丙氨酸的生产(3)溶氧条件的控制•:・现有的分离纯化技术包括锌盐沉淀法、等电点中和法、活性炭吸附提取法、有机溶剂提取法、离子交换提取法、乳化液膜法、以及大孔树脂吸附法。其中，大孔树脂吸附法具有易于操作、树脂再生容易、性能稳定、可反复使用、组分分离效果好、产品收率高等特点，适宜大规模生产。该方法已成为国内外该领域的研究重点。特别是HP20树脂，其对芳香族氨基酸特异吸附，能使反应混合液中的L・苯丙氨酸、技盐、及少量杂氨基酸和其它无机盐有效分离。•由于常规的分离技术在处理生物活性物质如蛋白质，氨基酸等时会有处）理量小、流程长、成本高、易失活和收率低等缺点。而在双水相系统中这些生物活性物质能在平衡两相中保持活性，避免了以上的缺点，所以双水相体系在生物工程领域的应用也越来越广泛。近来聚乙二醇/盐双水相体系萃取L・苯丙氨酸也收到一定的关注。；七、展望随着我国经济的快速发展和人民生活水平的提高，营养保健疗效食品越来越受青睐。人们注重甜味剂的质量、营养和保健功能。我国是一个十二亿人口的大国,饮料、食品、药品用新型甜味剂市场潜力巨大。开发和生产L一苯丙氨酸满足国外市场需要不仅可以为国家节省大量的外汇支出而且还可以出口创汇。•目前,我国已经基本掌握了L•苯丙氨酸微生物发酵法和酶法生产技术，在基因工程领域的研究也取得了一定进步。但是，在国际对L•苯丙氨酸需求旺盛的机遇下，我国的氨基酸产业在勇敢接受挑战的同时，还应该看到不足的方面：（1）应借助先进科学技术开发新式生产工艺或j改进生产工艺；（2）工业化生产的管理技术落后，设备闲置率高；（3）产学研究联结不紧密,一些实用的专利技术无法顺利的转化为生产力。•因此我国应不断完善生产技术，在生产工艺上加大创新力度，降）低生产成本，才有可能在未来的国际市场竞争中处于有利地位。3、改进分离纯化技术',)